اعليٰ درجه حرارت تي زندگي ويٽرو ۾ ليزر-گرم سون جي نانو پارٽيڪلز سان مشاهدو ڪيو ويو آهي

Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني. برائوزر جو نسخو توهان استعمال ڪري رهيا آهيو محدود CSS سپورٽ آهي. بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو). ساڳئي وقت ۾، مسلسل حمايت کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ پيش ڪنداسين.
Thermophiles microorganisms آهن جيڪي تيز گرمي پد تي ترقي ڪن ٿا. انهن جي مطالعي سان قيمتي معلومات مهيا ڪري سگهي ٿي ته زندگي ڪيئن انتهائي حالتن سان ٺهڪي اچي ٿي. تنهن هوندي، روايتي بصري خوردبيني سان اعلي درجه حرارت جي حالتن کي حاصل ڪرڻ ڏکيو آهي. مقامي مزاحمتي برقي حرارت جي بنياد تي ڪيترائي گهر ٺاهيل حل تجويز ڪيا ويا آهن، پر ڪو به آسان تجارتي حل ناهي. هن مقالي ۾، اسان مائڪرو اسڪيل ليزر حرارتي جي تصور کي متعارف ڪرايو ٿا خوردبيني جي ميدان تي نظر ثاني ڪرڻ لاءِ thermophile مطالعي لاءِ اعليٰ درجه حرارت مهيا ڪرڻ لاءِ جڏهن ته صارف جي ماحول کي نرم رکيو وڃي. اعتدال پسند ليزر جي شدت تي مائڪرو اسڪيل حرارت حاصل ڪري سگھجي ٿو سون نانو پارٽيڪل ڪوٽيڊ سبسٽرٽ استعمال ڪندي بايو مطابقت ۽ موثر روشني جاذب جي طور تي. مائڪرو اسڪيل فلوئڊ ڪنوڪشن، سيل برقرار رکڻ، ۽ سينٽرفيوگل ٿرموفورٽڪ موشن جا ممڪن اثرات بحث ٿيل آهن. اهو طريقو ٻن قسمن ۾ ڏيکاريو ويو آهي: (i) Geobacillus stearothermophilus، هڪ فعال Thermophilic بيڪٽيريا جيڪو تقريبا 65 ° C تي ٻيهر پيدا ٿئي ٿو، جنهن کي اسان ڏٺو آهي ته مائڪرو اسڪيل حرارتي حرارت هيٺ ڄمڻ، وڌڻ ۽ ترڻ؛ (ii) Thiobacillus sp.، هڪ بهترين طور تي هائپرٿرموفيلڪ آرڪيا. 80 ° C تي. هي ڪم جديد ۽ سستي مائڪرو اسڪوپي اوزار استعمال ڪندي Thermophilic microorganisms جي سادي ۽ محفوظ مشاهدي لاءِ رستو هموار ڪري ٿو.
اربين سالن کان، ڌرتيء تي زندگي ماحولياتي حالتن جي وسيع رينج کي ترتيب ڏيڻ لاء ترقي ڪئي آهي جيڪي ڪڏهن ڪڏهن اسان جي انساني نقطه نظر کان انتهائي سمجهي رهيا آهن. خاص طور تي، ڪي Thermophilic microorganisms (bacteria, archaea, fungi) جن کي thermophiles چئجي ٿو 45°C کان 122°C1, 2, 3, 4 تائين درجه حرارت جي حد ۾ وڌندا آهن. Thermophiles مختلف ماحولياتي نظامن ۾ رهن ٿا، جهڙوڪ گہرے سمنڊ جي هائيڊروٿرمل وينٽس، گرم اسپرنگ يا ٻرندڙ علائقن. انهن جي تحقيق گذريل ڪجهه ڏهاڪن کان گهٽ ۾ گهٽ ٻن سببن جي ڪري تمام گهڻي دلچسپي پيدا ڪئي آهي. پهرين، اسان انهن مان سکي سگهون ٿا، مثال طور، ڪيئن ٿرموفائلز 5، 6، اينزائمز 7، 8 ۽ جھليون 9 اهڙين تيز گرمي پد تي مستحڪم آهن، يا ڪيئن ٿرموفائلز تابڪاري جي انتهائي سطحن کي برداشت ڪري سگهن ٿا. ٻيو، اهي ڪيترن ئي اهم بايو ٽيڪنالاجي ايپليڪيشنن جو بنياد آهن 1,11,12 جهڙوڪ ايندھن جي پيداوار 13,14,15,16، ڪيميائي جوڙجڪ (ڊائي هائيڊرو، الڪوحل، ميٿين، امينو اسيد، وغيره) 17، بايومائننگ 18 ۽ Thermostable biocatalysts7,11, 13. خاص طور تي، هن وقت سڃاتل پوليميرس زنجير رد عمل (PCR)19 ۾ شامل آهي هڪ اينزيم (Taq پوليميرس) thermophilic بيڪٽيريا Thermus aquaticus کان ڌار ڪيو ويو آهي، دريافت ڪيل پهرين thermophiles مان هڪ.
بهرحال، Thermophiles جو مطالعو ڪو آسان ڪم نه آهي ۽ ڪنهن به حياتياتي ليبارٽري ۾ بهتر نه ٿو ڪري سگهجي. خاص طور تي، زندگين ٿرموفيلس کي ڪنهن به معياري روشني خوردبيني سان ويٽرو ۾ نه ڏسي سگهجي ٿو، جيتوڻيڪ تجارتي طور تي دستياب حرارتي چيمبرن سان، عام طور تي درجه حرارت 40 ° C کان گهٽ درجه حرارت لاء. 1990 جي ڏهاڪي کان وٺي، صرف چند ريسرچ گروپن پاڻ کي وقف ڪري ڇڏيو آهي اعلي گرمي پد جي مائڪرو اسڪوپي (HTM) سسٽم جي تعارف لاءِ. 1994 ۾ Glukh et al. حرارتي / کولنگ چيمبر کي پيلٽير سيل جي استعمال جي بنياد تي تصور ڪيو ويو جيڪو آئتاکاري ڪيپليئرز جي درجه حرارت کي ڪنٽرول ڪري ٿو جيڪو anaerobicity 20 کي برقرار رکڻ لاءِ بند ڪيو ويو آهي. ڊوائيس 2 °C/s جي رفتار سان 100 °C تائين گرم ٿي سگھي ٿو، ليکڪن کي هائپرٿرموفيلڪ بيڪٽيريا Thermotoga maritima21 جي حرڪت جو مطالعو ڪرڻ جي اجازت ڏئي ٿو. 1999 ۾ Horn et al. هڪ تمام گهڻو ساڳيو ڊوائيس تيار ڪيو ويو آهي، اڃا تائين سيل ڊويزن / ڪنيڪشن جي مطالعي لاء تجارتي خوردبيني لاء مناسب گرم ڪيپيلرن جي استعمال تي ٻڌل آهي. هڪ ڊگهي عرصي جي لاڳاپي جي غير فعال ٿيڻ کان پوء، مؤثر HTMs جي ڳولا 2012 ۾ ٻيهر شروع ٿي، خاص طور تي Wirth گروپ پاران ڪاغذن جي هڪ سلسلي جي سلسلي ۾، جيڪو هورن ايٽ ال جي ايجاد ڪيل هڪ ڊوائيس استعمال ڪيو. پندرهن سال اڳ، وڏي تعداد ۾ آرڪيا جي حرڪت، جنهن ۾ هائپر ٿرموفيل شامل هئا، 100 درجا سينٽي گريڊ تائين گرمي پد تي 23,24 گرم ڪيپيلري استعمال ڪندي اڀياس ڪيو ويو. انهن تيز گرمي حاصل ڪرڻ لاءِ اصل خوردبيني کي به تبديل ڪيو (مقرر ڪيل درجه حرارت تي پهچڻ لاءِ 35 منٽن جي بدران ڪيترائي منٽ) ۽ وچولي سطح تي 2 سينٽي کان وڌيڪ جي لينيئر گرمي پد جي درجي کي حاصل ڪيو. هي گرمي پد جي ترتيب ڏيڻ واري ڊيوائس (TGFD) کي استعمال ڪيو ويو آهي ڪيترن ئي thermophiles جي حرڪت جي مطالعي لاءِ درجه حرارت جي درجي جي اندر اندر حياتياتي طور تي لاڳاپيل فاصلن تي 24, 25.
بند ٿيل ڪيپيلرن کي گرم ڪرڻ ئي واحد طريقو ناهي جيڪو زنده ٿرموفيلس جو مشاهدو ڪري ٿو. 2012 ۾، Kuwabara et al. گھر جي ڊسپوزيبل پيريڪس چيمبرز کي گرمي مزاحمتي چپپڻ سان بند ڪيو ويو (سپر X2؛ سيميڊين، جاپان) استعمال ڪيا ويا. نمونا هڪ ​​تجارتي طور تي دستياب شفاف حرارتي پليٽ تي رکيا ويا (مائڪرو هيٽ پليٽ، ڪيتازاٽو ڪارپوريشن، جاپان) 110 ° سي تائين گرم ڪرڻ جي قابل، پر اصل ۾ بايو اميجنگ لاءِ نه هئا. ليکڪن 65 ° C تي anaerobic Thermophilic بيڪٽيريا (Thermosipho globiformans، ٻيڻو وقت 24 منٽ) جي موثر ڊويزن جو مشاهدو ڪيو. 2020 ۾، Pulshan et al. تجارتي ڌاتو جي وينجن جي موثر گرمائش (AttofluorTM، Thermofisher) ٻن گھر جي حرارتي عناصر استعمال ڪندي ڏيکاريو ويو: ھڪڙو لڪ ۽ ھڪڙو اسٽيج (PCR مشين کان متاثر ٿيل ترتيب). هي انجمن هڪ يونيفارم مائع جي درجه حرارت ۾ نتيجو آهي ۽ لڪ جي تري ۾ بخارات ۽ ڪنسنيشن کي روڪي ٿو. او-رنگ جو استعمال ماحول سان گئس جي مٽاسٽا کان بچي ٿو. هي HTM، جنهن کي سلفوسکوپ سڏيو ويندو آهي، استعمال ڪيو ويو سلفوولوبس ايسڊوڪلڊريس کي 75 ° C27 تي تصوير ڏيڻ لاء.
انهن سڀني سسٽم جي هڪ تسليم ٿيل حد هوا جي مقصدن جي استعمال تي پابندي هئي، ڪنهن به تيل جي وسرڻ اهڙي تيز درجه حرارت ۽ > 1-mm ٿلهي شفاف نموني ذريعي تصويرن لاءِ نا مناسب آهي. انهن سڀني سسٽم جي هڪ تسليم ٿيل حد هوا جي مقصدن جي استعمال تي پابندي هئي، ڪنهن به تيل جي وسرڻ اهڙي تيز درجه حرارت ۽ > 1-mm ٿلهي شفاف نموني ذريعي تصويرن لاءِ نا مناسب آهي. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективово, посех этих систем в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщиной > 1 انهن سڀني سسٽم جي هڪ تسليم ٿيل نقص هوا جي مقصدن جي استعمال جي حد هئي، ڇاڪاڻ ته ڪو به تيل وسرڻ مناسب نه هو اهڙي تيز گرمي پد لاءِ ۽ شفاف نموني جي ذريعي ڏسڻ لاءِ> 1 ملي ميٽر ٿلهي.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜،任何油浸都不适合这样都不镜厚的透明样品成像. انهن سڀني سسٽم جي هڪ تسليم ٿيل حد هڪ ايئر-انٽرائنڊ آئيني کي استعمال ڪرڻ جي حد آهي، ڇاڪاڻ ته ڪنهن به تيل جي وسرندڙ شفاف نموني جي تصويرن لاء مناسب نه آهي> 1 ملي ميٽر ٿلهي تي تيز گرمي پد تي. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, любовективов сло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. انهن سڀني سسٽم جي هڪ تسليم ٿيل خرابي ايئر لينس جو محدود استعمال آهي، ڪنهن به تيل جي وسرڻ اهڙي تيز گرمي پد لاءِ مناسب ناهي ۽ شفاف نموني> 1 ملي ميٽر ٿلهي ذريعي ڏسڻ.وڌيڪ تازو، هي حد چارلس-اورزگ et al پاران هٽايو ويو. 28، جنهن هڪ اهڙي ڊوائيس ٺاهي آهي جيڪا هاڻي دلچسپي جي سسٽم جي چوڌاري گرمي مهيا نه ڪندو آهي، بلڪه پاڻ کي ڍڪڻ واري شيشي جي اندر، ITO (انڊيم-ٽين آڪسائيڊ) جي ٺهيل هڪ رزسٽر جي پتلي شفاف پرت سان ڍڪيل آهي. لڪ کي 75 °C تائين گرم ڪري سگھجي ٿو شفاف پرت ذريعي برقي ڪرنٽ گذرڻ سان. بهرحال، ليکڪ کي لازمي طور تي لينس کي گرمي ڪرڻ گهرجي، پر 65 ° C کان وڌيڪ نه، جيئن ان کي نقصان نه پهچائي.
انهن ڪمن مان اهو ظاهر ٿئي ٿو ته موثر تيز گرمي پد واري نظرياتي مائڪرو اسڪوپي جي ترقي وڏي پيماني تي نه ڪئي وئي آهي، اڪثر ڪري گهر جي سامان جي ضرورت هوندي آهي، ۽ اڪثر ڪري مقامي حل جي قيمت تي حاصل ڪيو ويندو آهي، جيڪو هڪ سنگين نقصان آهي، جنهن کي ڏنو ويو آهي ته Thermophilic microorganisms چند کان وڌيڪ نه آهن. مائڪرو ميٽر HTM جي ٽن موروثي مسئلن کي حل ڪرڻ جي ڪنجي آهي حرارتي مقدار ۾ گھٽتائي: خراب فضائي ريزوليوشن، تيز حرارتي جڙت جڏهن سسٽم گرم ٿئي ٿو، ۽ آس پاس جي عناصرن کي نقصانڪار گرم ڪرڻ (وسرندڙ تيل، مقصدي لينس... يا صارف جا هٿ) انتهائي گرمي پد تي. ).
هن مقالي ۾، اسان thermophile مشاهدي لاء هڪ HTM متعارف ڪرايو آهي جيڪو مزاحمتي گرمي تي ٻڌل ناهي. ان جي بدران، اسان هڪ محدود علائقي جي اندر مقامي گرمائش حاصل ڪئي خوردبيني جي نظر جي فيلڊ جي ليزر شعاع ذريعي روشني جذب ڪندڙ سبسٽرٽ. درجه حرارت جي ورڇ کي استعمال ڪيو ويو مقداري مرحلو مائڪرو اسڪوپي (QPM) استعمال ڪندي. هن طريقي جي اثرائيت جو مظاهرو ڪيو ويو آهي Geobacillus stearothermophilus، هڪ متحرڪ Thermophilic بيڪٽيريا جيڪو تقريبا 65 ° C تي ٻيهر پيدا ٿئي ٿو ۽ هڪ ننڍڙو ٻه ڀيرا وقت آهي (اٽڪل 20 منٽ)، ۽ سلفولوبس شيباٽي، هڪ هائپر ٿرموفيل جيڪو بهتر طور تي وڌندو آهي (80 ° C) بيان ڪرڻ. عام نقل جي شرح ۽ ترڻ کي درجه حرارت جي ڪم طور ڏٺو ويو. هي ليزر HTM (LA-HTM) محدود نه آهي coverslip جي ٿلهي يا مقصد جي نوعيت (هوا يا تيل جي وسرندڙ). هي اجازت ڏئي ٿو ڪنهن به اعلي ريزوليوشن لينس کي مارڪيٽ تي استعمال ڪرڻ جي. اهو پڻ سست حرارتي حرڪت کان متاثر نه ٿئي ٿو حرارتي جڙت جي ڪري (هڪ ملي سيڪنڊ پيماني تي فوري طور تي گرمي حاصل ڪري ٿو) ۽ صرف تجارتي طور تي دستياب اجزاء استعمال ڪري ٿو. صرف نوان حفاظتي خدشا ڊوائيس اندر طاقتور ليزر بيم (عام طور تي 100 ميگاواٽ تائين) جي موجودگي سان لاڳاپيل آهن ۽ ممڪن طور تي اکين جي ذريعي، جن کي حفاظتي چشمن جي ضرورت هوندي آهي.
LA-HTM جو اصول اهو آهي ته ليزر استعمال ڪرڻ لاءِ مقامي طور نموني کي گرم ڪرڻ لاءِ خوردبيني جي نظر جي ميدان ۾ (تصوير 1a). هن کي ڪرڻ لاء، نموني کي روشني جذب ڪرڻ گهرجي. مناسب ليزر پاور استعمال ڪرڻ لاءِ (100 ميگاواٽ کان گھٽ)، اسان مائع وچولي ذريعي روشني جي جذب تي ڀروسو نه ڪيو، پر مصنوعي طور تي نموني جي جذب کي وڌايو سون جي نانو ذرات (تصوير 1c) سان سبسٽريٽ جي کوٽ ڪري. سون جي نانو ذرات کي روشنيءَ سان گرم ڪرڻ حرارتي پلازمونڪس جي شعبي لاءِ بنيادي اهميت رکي ٿو، بائيو ميڊيسن، نانو ڪيمسٽري يا سج جي روشني 29,30,31 ۾ متوقع ايپليڪيشنن سان. گذريل ڪجھ سالن کان، اسان فزڪس، ڪيمسٽري ۽ حياتيات ۾ حرارتي پلازما ايپليڪيشنن سان لاڳاپيل ڪيترن ئي مطالعي ۾ هي LA-HTM استعمال ڪيو آهي. هن طريقي سان بنيادي مشڪل آخري درجه حرارت جي پروفائيل کي ظاهر ڪرڻ ۾ آهي، ڇاڪاڻ ته بلند درجه حرارت نموني جي اندر مائڪرو اسڪيل علائقي تائين محدود آهي. اسان اهو ڏيکاريو آهي ته گرمي پد جي ماپنگ کي چار-ويولنگٿ ٽرانسورس شيئر انٽرفيروميٽر سان حاصل ڪري سگهجي ٿو، هڪ سادي، اعليٰ ريزوليوشن، ۽ مقداري مرحلي جي مائڪرو اسڪوپي جو تمام گهڻو حساس طريقو، جنهن جي بنياد تي ٻه-dimensional diffraction gratings (جنهن کي ڪراس گريٽنگ پڻ چيو ويندو آهي) جي استعمال تي ٻڌل آهي. 33,34,35,36. هن حرارتي مائڪرو اسڪوپي ٽيڪنڪ جي اعتبار، ڪراسڊ گريٽنگ ويف فرنٽ مائڪرو اسڪوپي (سي جي ايم) جي بنياد تي، گذريل ڏهاڪي ۾ شايع ٿيل هڪ درجن ڪاغذن ۾ ظاهر ڪيو ويو آهي 37,38,39,40,41,42,43.
متوازي ليزر حرارتي، شڪل ڏيڻ ۽ گرمي پد جي خوردبيني جي تنصيب جو منصوبو. b نمونو جاميٽري هڪ AttofluorTM چيمبر تي مشتمل آهي جنهن ۾ گولڊ نانو پارٽيڪلز سان ڍڪيل ڍڪيل لپ شامل آهن. c نموني کي ويجهي ڏسو (پيماني تي نه). d يونيفارم ليزر بيم پروفائل جي نمائندگي ڪري ٿو ۽ (e) سون جي نانو پارٽيڪلز جي نموني جهاز تي بعد ۾ درجه حرارت جي ورڇ جي نقلي. f هڪ اينولر ليزر بيم پروفائل آهي جيڪو هڪ يونيفارم گرمي پد پيدا ڪرڻ لاءِ موزون آهي جيئن (g) ۾ ڏيکاريل نتيجن جي درجه حرارت جي ورڇ جي تخليق ۾ ڏيکاريل آهي. اسڪيل بار: 30 µm.
خاص طور تي، اسان تازو LA-HTM ۽ CGM سان ٿلهي جي خاني جي گرمائش حاصل ڪئي ۽ 37-42 ° C جي حد ۾ سيلولر گرمي جھٽڪن جي جوابن کي ٽريڪ ڪيو، هن ٽيڪنڪ جي قابل اطلاق واحد جاندار سيل اميجنگ کي ظاهر ڪيو. بهرحال، LA-HTM جو استعمال تيز گرمي پد تي مائڪروجنزمن جي مطالعي لاءِ غير واضح نه آهي، ڇاڪاڻ ته ان کي ٿلهي جي خاني جي مقابلي ۾ وڌيڪ احتياط جي ضرورت آهي: پهريون، وچولي جي تري کي ڏهن درجن تائين گرم ڪرڻ سان (بجائي ڪي درجا) هڪ مضبوط عمودي درجه حرارت جي درجي تائين. fluid convection 44 ٺاهي سگھي ٿو، جيڪو، جيڪڏھن مضبوطيءَ سان ذيلي ذخيري سان جڙيل نه ھجي، ته بيڪٽيريا جي اڻ وڻندڙ ​​حرڪت ۽ ميلاپ جو سبب بڻجي سگھي ٿو. هي نقل و حمل مائع پرت جي ٿلهي کي گهٽائڻ سان ختم ڪري سگهجي ٿو. هن مقصد لاءِ، هيٺ پيش ڪيل سڀني تجربن ۾، بيڪٽيريا معطلي کي ٻن ڍڪين جي وچ ۾ رکيل هئي تقريبن 15 µm ٿلهي هڪ ڌاتو کپ جي اندر رکيل آهي (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). اصول ۾، ڪنوڪشن کان بچي سگهجي ٿو جيڪڏهن مائع جي ٿولهه حرارتي ليزر جي بيم جي سائيز کان ننڍو آهي. ٻيو ته، اهڙي محدود جاميٽري ۾ ڪم ڪرڻ سان ايروبڪ جاندارن جو ساهه بند ٿي سگهي ٿو (ڏسو تصوير S2). ھن مسئلي کان بچي سگھجي ٿو ھڪڙو ذيلي ذرو استعمال ڪرڻ سان جيڪو آڪسيجن (يا ڪنھن ٻئي ضروري گيس) ۾ داخل ٿئي ٿو، ڍڪيل ھوائي بلبلن کي ڍڪڻ جي ذريعي، يا مٿين ڍڪ ۾ سوراخ ڪرڻ سان (ڏسو تصوير S1) 45. هن مطالعي ۾، اسان پوئين حل کي چونڊيو (تصويرون 1b ۽ S1). آخرڪار، ليزر حرارتي يونيفارم درجه حرارت جي ورڇ فراهم نه ڪندو آهي. ليزر شعاع جي ساڳئي شدت تي به (تصوير 1d)، گرمي پد جي ورڇ هڪجهڙائي نه آهي، بلڪه حرارتي تفاوت (Fig. 1e). جڏهن مقصد حياتياتي نظام جي مطالعي لاءِ ڏسڻ جي ميدان ۾ درست درجه حرارت قائم ڪرڻ هوندو آهي، ته اڻ برابري پروفائلز مثالي نه هوندا آهن ۽ اهي بيڪٽيريا جي Thermophoretic حرڪت کي به ڏسندا آهن جيڪڏهن اهي ذيلي ذخيري تي عمل نه ڪندا آهن (ڏسو تصوير. S3, S4) 39. ان جي نتيجي ۾، اسان نموني جي جهاز ۾ انگوزي جي شڪل (Fig. 1f) جي مطابق انفراريڊ ليزر بيم کي شڪل ڏيڻ لاءِ هڪ اسپيشل لائيٽ ماڊلٽر (SLM) استعمال ڪيو ته جيئن ڏنل جاميٽري علائقي ۾ مڪمل طور تي هڪجهڙائي واري درجه حرارت جي ورڇ حاصل ڪئي وڃي، حرارتي ڦهلاءَ جي باوجود (Fig. 1d) 39, 42, 46. هڪ ڌاتوءَ جي ٿلهي (Figure 1b) مٿان هڪ مٿو ڍڪيو ته جيئن وچولي جي بخار ٿيڻ کان بچڻ لاءِ ۽ گهٽ ۾ گهٽ ڪجهه ڏينهن تائين مشاهدو ڪيو وڃي. ڇاڪاڻ ته هي مٿين ڍڪيل سيل نه آهي، اضافي وچولي کي آساني سان شامل ڪري سگهجي ٿو ڪنهن به وقت جيڪڏهن ضروري هجي.
واضع ڪرڻ لاءِ ته LA-HTM ڪيئن ڪم ڪري ٿو ۽ thermophilic تحقيق ۾ ان جي قابل اطلاقيت کي ظاهر ڪرڻ لاءِ، اسان ايروبڪ بيڪٽيريا جيوباڪيلس اسٽيروٿرموفيلس جو اڀياس ڪيو، جن جي وڌ ۾ وڌ واڌ جي درجه حرارت 60-65 °C جي لڳ ڀڳ آهي. بيڪٽيريا ۾ پڻ flagella ۽ ترڻ جي صلاحيت آهي، جيڪا عام سيلولر سرگرمي جو هڪ ٻيو اشارو مهيا ڪري ٿي.
نمونا (تصوير 1b) هڪ ڪلاڪ لاءِ 60 ڊگري سينٽي گريڊ تي اڳ ۾ رکيا ويا ۽ پوءِ LA-HTM نموني هولڊر ۾ رکيا ويا. هي پري انڪيوبيشن اختياري آهي، پر اڃا به ڪارائتو آهي، ٻن سببن لاءِ: پهريون، جڏهن ليزر آن ڪيو وڃي ٿو، ته اهو سيلز کي فوري طور تي وڌڻ ۽ ورهائڻ جو سبب بڻجي ٿو (ڏسو فلم M1 ضمني مواد ۾). اڳ-انڪيوبيشن جي بغير، بيڪٽيريا جي واڌ عام طور تي تقريبا 40 منٽن تائين دير ٿي ويندي آهي هر وقت نموني تي نئين ڏسڻ واري علائقي کي گرم ڪيو ويندو آهي. ٻيو، 1 ڪلاڪ اڳ-انڪيوبيشن بيڪٽيريا جي ڳنڍي کي ڍڪڻ کي وڌايو، thermophoresis جي ڪري سيلز کي ڏسڻ جي ميدان کان ٻاهر نڪرڻ کان روڪيو جڏهن ليزر آن ڪيو ويو (ڏسو فلم M2 ضمني مواد ۾). Thermophoresis ذرڙن يا ماليڪيولن جي حرڪت آهي درجه حرارت جي درجه بندي سان، عام طور تي گرم کان ٿڌي تائين، ۽ بيڪٽيريا ڪو به استثنا نه آهي 43,47. هي اڻ وڻندڙ ​​اثر هڪ ڏنل علائقي تي ختم ڪيو ويندو آهي SLM استعمال ڪندي ليزر بيم کي شڪل ڏيڻ ۽ فليٽ درجه حرارت جي تقسيم حاصل ڪرڻ لاءِ.
انجير تي. شڪل 2 ڏيکاري ٿو درجه حرارت جي ورڇ جي ماپ CGM پاران حاصل ڪيل شيشي جي ذيلي ذخيري کي شعاع ڪندي سون جي نانو ذرات سان گڏ هڪ اينولر ليزر بيم (تصوير 1f). ليزر شعاع سان ڍڪيل سڄي علائقي تي هڪ لوڻ جي درجه حرارت جي ورڇ ڏٺو ويو. ھن زون کي 65 ° C تي مقرر ڪيو ويو، بھترين واڌ جي درجه حرارت. هن علائقي کان ٻاهر، گرميءَ جو وکر قدرتي طور تي اچي ٿو \(1/r\) (جتي \(r\) ريڊيل ڪوآرڊينيٽ آهي).
CGM ماپن جو هڪ درجه حرارت نقشو حاصل ڪيو ويو هڪ اينولر ليزر بيم استعمال ڪندي سون جي نانو پارٽيڪلز جي هڪ پرت کي روشن ڪرڻ لاءِ هڪ گول علائقي تي فليٽ درجه حرارت پروفائل حاصل ڪرڻ لاءِ. ب درجه حرارت جي نقشي جو Isotherm (a). ليزر شعاع جو سموچ هڪ سرمائي ڊاٽ ٿيل دائري سان ظاھر ٿئي ٿو. تجربو ٻه ڀيرا ورجايو ويو (ڏسو اضافي مواد، شڪل S4).
LA-HTM استعمال ڪندي ڪيترن ئي ڪلاڪن تائين بيڪٽيريا سيلز جي قابليت جي نگراني ڪئي وئي. انجير تي. 3 3 ڪلاڪ 20 منٽ جي فلم (مووي M3، اضافي معلومات) مان ورتل چار تصويرن لاءِ وقت جو وقفو ڏيکاري ٿو. بيڪٽيريا کي ليزر پاران بيان ڪيل سرڪلر ايريا جي اندر فعال طور تي پکيڙڻ جو مشاهدو ڪيو ويو جتي گرمي پد 65 ° C جي ويجهو پهچي ويو. ان جي ابتڙ، سيل جي واڌ کي خاص طور تي گهٽجي ويو جڏهن درجه حرارت 50 ° C کان هيٺ ٿي ويو 10 s تائين.
مختلف وقتن تي ليزر گرم ڪرڻ کان پوءِ وڌندڙ G. اسٽيروٿرموفيلس بيڪٽيريا جون نظرياتي کوٽائي واريون تصويرون، (a) t = 0 منٽ، (b) 1 h 10 منٽ، (c) 2 h 20 منٽ، (d) 3 h 20 منٽ، ٻاهر 200 هڪ منٽ جي فلم مان ڪڍيا ويا (ضمني معلومات ۾ مهيا ڪيل M3 فلم) ساڳئي درجه حرارت جي نقشي تي سپرمپوز ٿيل. ليزر وقت تي آن ٿئي ٿو \(t=0\). Isotherms کي شدت واري تصوير ۾ شامل ڪيو ويو آھي.
سيل جي واڌ ۽ ان جي انحصار کي گرمي پد تي وڌيڪ مقدار ڏيڻ لاءِ، اسان مووي M3 فيلڊ آف ڏيک ۾ شروعاتي طور تي الڳ ٿيل بيڪٽيريا جي مختلف نوآبادين جي بايوماس ۾ واڌ کي ماپيو (تصوير 4). ميني ڪالوني فارمنگ يونٽ (mCFU) ٺهڻ جي شروعات ۾ چونڊيل والدين بيڪرياريا کي شڪل S6 ۾ ڏيکاريو ويو آهي. خشڪ ماس جي ماپ کي CGM 48 ڪئميرا سان ورتو ويو جيڪو درجه حرارت جي ورڇ کي ماپ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. خشڪ وزن ۽ درجه حرارت کي ماپڻ لاء CGM جي صلاحيت LA-HTM جي طاقت آهي. جيئن توقع ڪئي وئي، تيز گرمي سبب بيڪٽيريا جي ترقي تيز ٿي وئي (تصوير 4a). جيئن تصوير 4b ۾ سيمي لاگ پلاٽ ۾ ڏيکاريو ويو آهي، سڀني درجه حرارت تي واڌ واڌ جي واڌ جي پٺيان لڳندي آهي، جتي ڊيٽا استعمال ڪري ٿي ايڪسپورنيشنل فنڪشن \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau}+ {{ \mbox{cst}}}، جتي \(\tau {{{{\rm{log }}}}}} 2\) - نسل جو وقت (يا ٻيڻو وقت)، \( g =1/ \ tau \) - واڌ جي شرح (في يونٽ وقت ڊويزن جو تعداد). انجير تي. 4c درجه حرارت جي ڪم جي طور تي لاڳاپيل ترقي جي شرح ۽ نسل جو وقت ڏيکاري ٿو. تيزيءَ سان وڌندڙ mCFUs ٻن ڪلاڪن کان پوءِ ترقي جي سنترپشن سان منسوب ڪيا ويا آهن، هڪ متوقع رويي جي ڪري بيڪٽيريا جي کثافت جي ڪري (جهڙوڪ ڪلاسيڪل مائع ثقافتن ۾ اسٽيشنري مرحلي وانگر). عام شڪل \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) G. stearothermophilus لاءِ متوقع ٻن مرحلن واري وکر سان مطابقت رکي ٿي جيڪا 60-65 °C جي چوڌاري وڌ ۾ وڌ واڌ جي شرح سان آهي. ڪارڊينل ماڊل استعمال ڪندي ڊيٽا کي ملايو (Figure S5)49 جتي \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt}} ؛{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2؛ 40 ± 4؛ 65 ± 1.6؛ 67 ± 3) °C، جيڪو ادب ۾ بيان ڪيل ٻين قدرن سان چڱي ريت متفق آهي49. جيتوڻيڪ گرمي پد تي دارومدار مادو ٻيهر پيدا ڪري سگهجن ٿا، وڌ ۾ وڌ واڌ جي شرح \({G}_{0}\) هڪ تجربي کان ٻئي تائين مختلف ٿي سگهي ٿي (ڏسو انگ اکر S7-S9 ۽ فلم M4). ان جي ابتڙ گرمي پد جي ماپن جي ماپ، جيڪا آفاقي هجڻ گهرجي، وڌ ۾ وڌ واڌ جي شرح جو دارومدار مائيڪرو اسڪيل جيوميٽري ۾ وچولي (غذائي مواد جي دستيابي، آڪسيجن ڪنسنٽريشن) جي خاصيتن تي منحصر آهي.
مختلف درجه حرارت تي مائڪروبيل ترقي. mCFU: ننڍي ڪالوني ٺاهڻ وارا يونٽ. ڊيٽا حاصل ڪئي وئي هڪ وڊيو مان حاصل ڪيل هڪ بيڪٽيريا جي درجه حرارت جي درجي ۾ وڌندڙ (فلم M3). b ساڳيو (a)، نيم-لوگارٿمڪ اسڪيل. c واڌ جي شرح\(\tau\) ۽ نسل جو وقت\(g\) لڪير جي رجعت (b) مان ڳڻيو ويو. افقي نقص بار: درجه حرارت جي حد جنهن جي مٿان mCFUs واڌ جي دوران منظر جي ميدان ۾ وڌايو ويو. عمودي غلطي بار: لڪير ريگريشن معياري غلطي.
عام واڌ ويجهه کان علاوه، ڪجهه بيڪٽيريا ڪڏهن ڪڏهن ليزر گرمائش دوران نظر ۾ تري ويندا آهن، جيڪو فلاجلا سان گڏ بيڪٽيريا لاءِ متوقع رويو آهي. فلم M5 اضافي معلومات ۾ ڏيکاري ٿو اهڙي ترڻ جي سرگرمين. هن تجربي ۾، يونيفارم ليزر شعاع استعمال ڪيو ويو ته جيئن درجه حرارت جي درجي بندي پيدا ٿئي، جيئن شڪل 1d، e ۽ S3 ۾ ڏيکاريل آهي. شڪل 5 M5 فلم مان چونڊيل ٻه تصويري سلسلو ڏيکاري ٿو ڏيکاري ٿو ته هڪ بيڪٽيريا هدايت واري حرڪت کي ظاهر ڪري ٿو جڏهن ته ٻيا سڀئي بيڪٽيريا بي حرڪت رهن ٿا.
ٻه ٽائيم فريم (a) ۽ (b) ڊاٽ ٿيل دائرن سان نشان لڳل ٻن مختلف بيڪٽيريا جي ترڻ کي ڏيکاري ٿو. تصويرون M5 فلم مان ڪڍيا ويا (اضافي مواد جي طور تي مهيا ڪيل).
G. stearothermophilus جي صورت ۾، بيڪٽيريا جي فعال حرڪت (Fig. 5) ليزر جي شعاع کي چالو ٿيڻ کان ڪجهه سيڪنڊن بعد شروع ٿي. هي مشاهدو هن Thermophilic microorganism جي عارضي ردعمل تي زور ڏئي ٿو گرمي پد ۾ اضافو، جيئن اڳ ۾ ئي Mora et al پاران مشاهدو ڪيو ويو آهي. 24 . LA-HTM استعمال ڪندي بيڪٽيريا جي متحرڪ ۽ حتي Thermotaxis جي موضوع کي وڌيڪ ڳولي سگھجي ٿو.
خوردبيني ترڻ کي ٻين قسمن جي جسماني حرڪت سان نه ٺهڪائڻ گهرجي، يعني (i) براونين موشن، جيڪا ظاهر ٿئي ٿي ته اڻ سڌيءَ طرف کان افراتفري واري حرڪت آهي، (ii) ڪنويڪيشن 50 ۽ thermophoresis 43، جنهن ۾ گرمي پد سان گڏ حرڪت جي باقاعده وهڪري تي مشتمل هوندي آهي. گريجوئيٽ
G. stearothermophilus ان جي قابليت جي ڪري مشهور آهي ته ان جي انتهائي مزاحمتي spores (spor formation) پيدا ڪرڻ جي صلاحيت رکي ٿي جڏهن دفاعي طور تي خراب ماحولياتي حالتن جي سامهون اچي ٿي. جڏهن ماحولياتي حالتون ٻيهر سازگار ٿي وينديون آهن، spores ڄمندا آهن، جاندار سيلز ٺاهيندا آهن ۽ ٻيهر ترقي شروع ڪندا آهن. جيتوڻيڪ هي اسپوروليشن/ اُچارڻ وارو عمل چڱيءَ طرح ڄاتو وڃي ٿو، پر اهو ڪڏهن به حقيقي وقت ۾ نه ڏٺو ويو آهي. LA-HTM استعمال ڪندي، اسان هتي رپورٽ ڪريون ٿا G. stearothermophilus ۾ germination واقعن جو پهريون مشاهدو.
انجير تي. 6a 13 اسپورز جي CGM سيٽ استعمال ڪندي حاصل ڪيل آپٽيڪل ڊيپٿ (OT) جي وقت گذرڻ واريون تصويرون ڏيکاري ٿو. پوري گڏ ڪرڻ واري وقت لاءِ (15 h 6 منٽ، \(t=0\) - ليزر گرمائش جي شروعات)، 13 مان 4 spores ڄميا، لڳاتار وقت جي پوائنٽن تي \(t=2\) h، \( 3\ )h \(10 \)'، \(9\) h \(40\)' ۽ \(11\) h \(30\)'. جيتوڻيڪ انهن واقعن مان صرف هڪ تصوير 6 ۾ ڏيکاريو ويو آهي، 4 جراثيم جي واقعن کي M6 فلم ۾ ضمني مواد ۾ ڏسي سگهجي ٿو. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، اڀرڻ بي ترتيب نظر اچي ٿو: ماحولياتي حالتن ۾ ساڳئي تبديلين جي باوجود، سڀ spores هڪ ئي وقت نه اڀرن ٿا ۽ نه ئي اڀرن ٿا.
A Time-lapse جنهن ۾ 8 OT تصويرن تي مشتمل آهي (تيل وسرڻ، 60x، 1.25 NA مقصد) ۽ (b) بائيو ماس ارتقا جي G. اسٽريٿرموفيلس ايگريگيٽس. c (b) سيمي لاگ اسڪيل تي ٺهيل ترقي جي شرح جي لڪير کي اجاگر ڪرڻ لاءِ (ڊيش ٿيل لڪير).
انجير تي. 6b،c ڏيکاري ٿو سيل جي آبادي جي بايوماس کي ڏسڻ جي ميدان ۾ ڊيٽا گڏ ڪرڻ جي پوري عرصي دوران وقت جي فنڪشن جي طور تي. خشڪ ماس جي تيز زوال جو مشاهدو \(t=5\)h تي انجير ۾. 6b، c، ڏسڻ جي ميدان مان ڪجهه سيلز جي نڪرڻ سبب. انهن چئن واقعن جي واڌ جي شرح \(0.77\pm 0.1\) h-1 آهي. اها قيمت شڪل 3. 3 ۽ 4 سان لاڳاپيل ترقي جي شرح کان وڌيڪ آهي، جتي سيلز عام طور تي وڌندا آهن. spores مان G. stearothermophilus جي وڌندڙ شرح جو سبب واضح ناهي، پر اهي ماپون LA-HTM جي دلچسپي کي اجاگر ڪن ٿيون ۽ سيل جي زندگي جي متحرڪات بابت وڌيڪ سکڻ لاءِ سنگل سيل جي سطح (يا واحد mCFU سطح تي) ڪم ڪن ٿيون. .
LA-HTM جي استحڪام ۽ اعلي درجه حرارت تي ان جي ڪارڪردگي کي وڌيڪ ڏيکارڻ لاء، اسان سلفولوبس شيباٽي جي واڌ کي جانچيو، هڪ هائپرٿرموفيلڪ ايسڊفوفيلڪ آرڪيا 80 ° C51 جي وڌ کان وڌ واڌ جي درجه حرارت سان. G. stearothermophilus جي مقابلي ۾، اهي آرڪيا به هڪ تمام مختلف مورفولوجي آهي، جيڪا 1 مائڪرن جي گولن (cocci) جي بجاءِ ڊگھي ڇنڊن (bacilli) وانگر آهي.
شڪل 7a S. shibatae mCFU جي ترتيب واري بصري کوٽائي واري تصويرن تي مشتمل آھي جيڪا CGM استعمال ڪندي حاصل ڪئي وئي آھي (اضافي مواد ۾ M7 فيچر فلم ڏسو). هي mCFU وڌ ۾ وڌ 73 ° C تي، وڌ ۾ وڌ درجه حرارت 80 ° C کان هيٺ، پر فعال واڌ لاءِ درجه حرارت جي حد اندر. اسان ڪيترن ئي فِشن واقعن جو مشاهدو ڪيو جن mCFUs کي ڪجهه ڪلاڪن کان پوءِ آرڪيا جي مائڪرو گرافي وانگر نظر آيو. انهن OT تصويرن مان، mCFU بايوماس وقت جي مٿان ماپي وئي ۽ شڪل 7b ۾ پيش ڪئي وئي. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، S. shibatae mCFUs G. stearothermophilus mCFUs سان ڏسڻ ۾ ايندڙ ظاھراتي واڌ جي بجاءِ سڌريل واڌ ڏيکاريا آھن. سيل جي واڌ جي شرح جي نوعيت جي باري ۾ هڪ ڊگهي بحث 52 آهي: جڏهن ته ڪجهه مطالعو ٻڌايو آهي ته مائڪروبس جي واڌ جي شرح جيڪي انهن جي سائيز جي تناسب آهن (تفصيلي ترقي)، ٻيا هڪ مسلسل شرح ڏيکاريندا آهن (ليڪ يا بلائنر ترقي). جيئن ته Tzur et al.53 پاران وضاحت ڪئي وئي آهي، ايڪسپورنشل ۽ (bi) لڪير جي وچ ۾ فرق ڪرڻ لاءِ بايوماس جي ماپن ۾ <6% جي درستگي جي ضرورت آهي، جيڪا اڪثر QPM ٽيڪنالاجي جي پهچ کان ٻاهر آهي، حتي انٽرفيروميٽري به شامل آهي. جيئن ته Tzur et al.53 پاران وضاحت ڪئي وئي آهي، ايڪسپورنشل ۽ (bi) لڪير جي وچ ۾ فرق ڪرڻ لاءِ بايوماس جي ماپن ۾ <6% جي درستگي جي ضرورت آهي، جيڪا اڪثر QPM ٽيڪنالاجي جي پهچ کان ٻاهر آهي، حتي انٽرفيروميٽري به شامل آهي. Как объяснили Цур и др.53، различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в измерениях бисмерениях бисмерениях бисодом льшинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. جيئن بيان ڪيو ويو آهي Zur et al.53، تفاوت ۽ (bi) لڪير جي واڌ جي وچ ۾ فرق ڪرڻ جي ضرورت آهي <6٪ بايوماس جي ماپن ۾، جيڪا اڪثر QPM طريقن لاءِ حاصل نه ٿي ڪري سگهجي، جيتوڻيڪ انٽرفيروميٽري استعمال ڪندي.جيئن وضاحت ڪئي وئي Zur et al. 53، ايڪسپورنشنل ۽ (bi) لڪير جي وچ ۾ فرق ڪرڻ لاءِ بايوماس جي ماپن ۾ 6 سيڪڙو کان گهٽ درستگي جي ضرورت هوندي آهي، جيڪا اڪثر QPM طريقن لاءِ حاصل نه ٿي سگهندي آهي، جڏهن ته انٽرفيروميٽري استعمال ٿيندي آهي. CGM بايوماس جي ماپ 36,48 ۾ ذيلي pg جي درستگي سان هن درستگي کي حاصل ڪري ٿو.
A Time-lapse جنهن ۾ 6 OT تصويرون شامل آهن (تيل وسرڻ، 60x، NA مقصد 1.25) ۽ (b) CGM سان ماپيل مائڪرو-CFU بايوماس ارتقا. ڏسو فلم M7 وڌيڪ معلومات لاءِ.
S. shibatae جي مڪمل طور تي سڌريل ترقي غير متوقع هئي ۽ اڃا تائين رپورٽ نه ڪئي وئي آهي. جڏهن ته، تيزيءَ سان واڌ جي توقع آهي، گهٽ ۾ گهٽ ڇاڪاڻ ته وقت گذرڻ سان گڏ، 2، 4، 8، 16 … سيلن جا ڪيترائي ڀاڱا ٿيڻ گهرجن. اسان اهو تصور ڪيو ته لڪير جي واڌ شايد سيل جي پابندي جي ڪري ٿي سگهي ٿي ٿلهي سيل پيڪنگ جي ڪري، جيئن سيل جي ترقي سست ٿئي ٿي ۽ آخرڪار هڪ غير فعال حالت تي پهچي ٿي جڏهن سيل جي کثافت تمام گهڻي آهي.
اسان نتيجي ۾ دلچسپي جي ھيٺين پنجن نقطن تي بحث ڪندي ختم ڪريون ٿا: گرمائش جي مقدار ۾ گھٽتائي، حرارتي جڙت ۾ گھٽتائي، سون جي نانو ذرات ۾ دلچسپي، مقدار جي مرحلي جي مائڪرو اسڪوپي ۾ دلچسپي، ۽ ممڪن درجه حرارت جي حد جنهن ۾ LA-HTM استعمال ڪري سگھجي ٿو.
مزاحمتي گرمائش جي مقابلي ۾، HTM ترقي لاءِ استعمال ٿيندڙ ليزر حرارتي ڪيترائي فائدا پيش ڪري ٿو، جن کي اسين هن مطالعي ۾ بيان ڪريون ٿا. خاص طور تي، خوردبيني جي نظر جي ميدان ۾ مائع ميڊيا ۾، حرارتي حجم ڪجهه (10 μm) 3 حجم اندر رکيل آهي. اهڙيءَ طرح، صرف مشاهدو ڪيل جراثيم فعال هوندا آهن، جڏهن ته ٻيا بيڪٽيريا غير فعال هوندا آهن ۽ نموني جي وڌيڪ مطالعي لاءِ استعمال ڪري سگھجن ٿا - هر دفعي نئين درجه حرارت جي جانچ ڪرڻ لاءِ نموني کي تبديل ڪرڻ جي ضرورت ناهي. ان کان علاوه، مائڪرو اسڪيل حرارتي درجه حرارت جي وڏي حد جي سڌي طرح امتحان جي اجازت ڏئي ٿي: شڪل 4c 3-ڪلاڪ فلم (مووي M3) مان حاصل ڪئي وئي، جنهن کي عام طور تي ڪيترن ئي نمونن جي تياري ۽ امتحان جي ضرورت هوندي آهي - مطالعي هيٺ هر هڪ نموني لاءِ. y اهو درجه حرارت آهي جيڪو تجربو ۾ ڏينهن جي تعداد جي نمائندگي ڪري ٿو. گرم حجم کي گھٽائڻ پڻ خوردبيني جي چوڌاري نظرياتي اجزاء، خاص طور تي مقصدي لينس، ڪمري جي حرارت تي رکي ٿو، جيڪو هن وقت تائين ڪميونٽي لاء هڪ وڏو مسئلو آهي. LA-HTM ڪنهن به لينس سان استعمال ڪري سگھجي ٿو، بشمول آئل وسرجن لينس، ۽ ڪمري جي گرمي پد تي رهندي جيتوڻيڪ منظر جي ميدان ۾ انتهائي گرمي پد سان. ليزر حرارتي طريقي جي بنيادي حد جيڪا اسان هن مطالعي ۾ رپورٽ ڪريون ٿا اهو آهي ته سيلز جيڪي نه ٿا رهن يا فلوٽ ٿين ٿا اهي ڏسڻ جي ميدان کان پري هوندا ۽ مطالعي ڪرڻ ڏکيو ٿي سگهي ٿو. ھڪڙو ڪم ڪار ٿي سگھي ٿو گھٽ ميگنيفڪيشن لينس استعمال ڪرڻ لاءِ ڪجھ سؤ مائڪرن کان وڌيڪ گرمي پد جي واڌ کي حاصل ڪرڻ لاءِ. هي احتياط فضائي ريزوليوشن ۾ گهٽتائي سان گڏ آهي، پر جيڪڏهن مقصد مائڪروجنزم جي حرڪت جو مطالعو ڪرڻ آهي، ته اعليٰ فضائي ريزوليوشن جي ضرورت ناهي.
سسٽم کي گرم ڪرڻ (۽ کولڻ) لاءِ ٽائيم اسڪيل \({{{{\rm{\tau }}}}}}}__{{{\mbox{D}}}}\) ان جي سائيز تي منحصر آهي، قانون موجب \({{{({\rm{\tau }}}}}}__{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\)، جتي \ (L\ ) گرميءَ جي ماخذ جي خصوصيت جي ماپ آهي (اسان جي مطالعي ۾ ليزر شعاع جو قطر \(L\ اٽڪل 100\) μm آهي)، \(D\) ماحول جي حرارتي تفاوت آهي (اوسط اسان جي مطالعي ۾ صورت، گلاس ۽ پاڻي جي پکيڙ جي شرح \ (ڊي \ اٽڪل 2 گنا {10}^{-7}\) m2/s). گرمي پد جي تبديلين جي توقع ڪري سگهجي ٿي، درجه حرارت جي واڌ جو اهو فوري قيام نه رڳو تجربي جي مدت کي مختصر ڪري ٿو، پر اهو پڻ اجازت ڏئي ٿو صحيح وقت \(t=0\) حرارت جي اثرات جي متحرڪ مطالعي لاء.
اسان جو تجويز ڪيل طريقو ڪنهن به روشني جذب ڪندڙ ذيلي ذخيري تي لاڳو ٿئي ٿو (مثال طور، ITO ڪوٽنگ سان تجارتي نموني). تنهن هوندي به، سون جي نانو ذرات انفراريڊ ۾ اعلي جذب مهيا ڪرڻ جي قابل آهن ۽ گهٽ جذب ڏسڻ واري حد ۾، جنهن جي بعد جون خاصيتون آهن جيڪي ڏسڻ واري حد ۾ موثر نظرياتي مشاهدي لاء دلچسپي رکن ٿيون، خاص طور تي جڏهن فلوروسينس استعمال ڪندي. ان کان علاوه، سون جيو مطابقت رکندڙ آهي، ڪيميائي طور تي غير فعال، نظرياتي کثافت کي 530 nm کان ويجهي انفراريڊ تائين ترتيب ڏئي سگهجي ٿو، ۽ نموني تيار ڪرڻ سادي ۽ اقتصادي آهي29.
Transverse grating wavefront microscopy (CGM) اجازت ڏئي ٿي نه رڳو گرمي پد جي ماپنگ مائڪرو اسڪيل تي، پر بايوماس مانيٽرنگ پڻ، ان کي خاص طور تي ڪارائتو بڻائي ٿي (جيڪڏهن ضروري نه هجي) LA-HTM سان ميلاپ ۾. گذريل ڏهاڪي دوران، ٻين گرمي پد جي مائڪرو اسڪوپي ٽيڪنالاجيون ترقي ڪيون ويون آهن، خاص طور تي بائيو اميجنگ جي ميدان ۾، ۽ انهن مان گھڻا گرمي پد-حساس فلورسنٽ پروبس 54,55 جي استعمال جي ضرورت آهي. بهرحال، انهن طريقن تي تنقيد ڪئي وئي آهي ۽ ڪجهه رپورٽن ۾ ماپ ڪئي وئي آهي غير حقيقي درجه حرارت جي تبديلين جي سيلن جي اندر، ممڪن آهي ته حقيقت جي سبب آهي ته فلوروسنس ڪيترن ئي عنصر تي منحصر آهي درجه حرارت کان سواء. ان کان سواء، اڪثر فلورسنٽ جاچ تيز گرمي پد تي غير مستحڪم آهن. تنهن ڪري، QPM ۽ خاص طور تي CGM هڪ مثالي گرمي پد جي مائڪرو اسڪوپي ٽيڪنڪ جي نمائندگي ڪري ٿو زندگي جي مطالعي لاء اعلي درجه حرارت تي نظرياتي مائڪرو اسڪوپي استعمال ڪندي.
S. shibatae جو مطالعو، جيڪي 80 ° C تي بهترين طور تي رهن ٿا، اهو ظاهر ڪن ٿا ته LA-HTM صرف سادي thermophiles نه، پر هائپر ٿرموفيلس جي مطالعي تي لاڳو ٿي سگهي ٿو. اصولي طور تي، درجه حرارت جي حد تائين ڪا حد ناهي جيڪا LA-HTM استعمال ڪندي پهچي سگهي ٿي، ۽ ايستائين جو 100 ° C کان مٿي گرمي پد کي هوا جي دٻاء تي بغير بغير بغير پهچائي سگهجي ٿو، جيئن اسان جي 38 گروپ پاران ڏيکاريل آهي هائڊرو تھرمل ڪيمسٽري ايپليڪيشنن ۾. پريشر A. ساڳيءَ طرح گولڊ نانو پارٽيڪل 40 کي گرم ڪرڻ لاءِ هڪ ليزر استعمال ڪيو ويندو آهي. اهڙيءَ طرح، LA-HTM کي معياري حالتن هيٺ (يعني ماحولياتي دٻاءُ هيٺ) معياري اعليٰ ريزوليوشن آپٽيڪل مائڪرو اسڪوپي سان بي مثال هائپرٿرموفيلس کي ڏسڻ لاءِ استعمال ڪرڻ جي صلاحيت آهي.
سڀئي تجربا گھر جي ٺهيل خوردبيني جي استعمال سان ڪيا ويا، جن ۾ ڪوهلر روشني (ايل اي ڊي، M625L3، Thorlabs، 700 ميگاواٽ سان)، دستي xy حرڪت سان نموني هولڊر، مقصد (اولمپس، 60x، 0.7 NA، ايئر، LUCPlanFLN60X، ONA50X، O. , UPLFLN60XOI)، CGM ڪئميرا (QLSI ڪراس گريٽنگ، 39 µm پچ، 0.87 mm Andor Zyla ڪئميرا سينسر کان) شدت ۽ موج فرنٽ اميجنگ مهيا ڪرڻ لاءِ، ۽ sCMOS ڪئميرا (ORCA Flash 4.0 V3، 16-bit موڊ، Hamamatsu کان رڪارڊ تائين) شڪل 5 ۾ ڏيکاريل ڊيٽا (بيڪٽيريل ترڻ). dichroic شعاع ورهائيندڙ هڪ 749 nm برائيٽ لائن ايج (Semrock، FF749-SDi01) آهي. ڪئميرا جي سامهون فلٽر هڪ 694 مختصر پاس فلٽر آهي (FF02-694 / SP-25، Semrock). Titanium sapphire ليزر (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W، پمپ ٿيل سونامي ليزر cavity، Spectra-physics in Fig. 2-5، وڌيڪ تبديل ڪيو ويو ملينيا ليزر، Spectraphysics 10 W، پمپ ٿيل ميرا ليزر ڪيفيت، F.2 لاءِ ڪوهيرنٽ، -5). 6 ۽ 7) موج جي ڊيگهه \({{{({\rm{\lambda }}}}}} = 800\) nm تي مقرر ڪيا ويا آهن، جيڪو سون جي نانو ذرات جي پلازمون گونج اسپيڪٽرم سان مطابقت رکي ٿو. اسپيشل لائيٽ ماڊلٽر (1920 × 1152 پکسلز) Meadowlark Optics مان خريد ڪيا ويا آھن ھولوگرام استعمال ڪندي گرچبرگ-سڪسٽن الگورتھم جيئن بيان ڪيو ويو آھي.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) هڪ آپٽيڪل مائڪرو اسڪوپي ٽيڪنڪ آهي جنهن تي ٻڌل آهي ٻه طرفي تفاوت گريٽنگ (جنهن کي ڪراس گريٽنگ به چيو ويندو آهي) هڪ ملي ميٽر جي مفاصلي تي روايتي ڪئميرا جي سينسر کان. CGM جو سڀ کان وڌيڪ عام مثال جيڪو اسان هن مطالعي ۾ استعمال ڪيو آهي، ان کي سڏيو ويندو آهي چار-ويولنگٿ ٽرانسورس شفٽ انٽرفيروميٽر (QLSI)، جتي ڪراس-گريٽنگ هڪ شدت/مرحلي چيڪ بورڊ جي نمونن تي مشتمل آهي متعارف ڪرايو ۽ پريموٽ ايٽ ال. 200034 ۾. عمودي ۽ افقي گريٽنگ لائينون سينسر تي گرڊ جھڙا پاڇا ٺاھين ٿيون، جن جي تحريف کي حقيقي وقت ۾ عددي طور تي پروسيس ڪري سگھجي ٿو ته جيئن واقعي واري روشني جي نظري موج جي تحريف (يا برابر فيز پروفائل) حاصل ڪري سگھجي. جڏهن هڪ خوردبيني تي استعمال ڪيو ويندو آهي، هڪ CGM ڪئميرا هڪ تصويري شئي جي نظرياتي رستي جي فرق کي ظاهر ڪري سگهي ٿو، جنهن کي آپٽيڪل ڊيپٿ (OT) جي نالي سان پڻ سڃاتو وڃي ٿو، حساسيت سان nanometers36 جي ترتيب تي. ڪنهن به CGM ماپ ۾، بصري اجزاء يا بيم ۾ ڪنهن به خرابي کي ختم ڪرڻ لاء، هڪ بنيادي حوالو OT تصوير وٺڻ گهرجي ۽ ڪنهن به ايندڙ تصويرن مان هٽايو وڃي.
درجه حرارت خوردبيني کي استعمال ڪيو ويو CGM ڪئميرا استعمال ڪندي جيئن بيان ڪيل حوالي سان. 32. مختصر ۾، مائع کي گرم ڪرڻ سان ان جي اضطراري انڊيڪس کي تبديل ڪري ٿو، هڪ حرارتي لينس جو اثر پيدا ڪري ٿو جيڪو واقعي جي شعاع کي خراب ڪري ٿو. هي wavefront تحريف CGM پاران ماپي ويندي آهي ۽ مائع وچولي ۾ ٽي-dimensional گرمي پد جي تقسيم حاصل ڪرڻ لاءِ ڊيڪونولوشن الگورٿم استعمال ڪندي پروسيس ڪئي ويندي آهي. جيڪڏهن سون جي نانو ذرڙن کي پوري نموني ۾ هڪجهڙائي سان ورهايو وڃي ٿو، بهتر تصويرون پيدا ڪرڻ لاءِ بيڪٽيريا کان پاڪ علائقن ۾ درجه حرارت جي ماپنگ ڪري سگهجي ٿي، جيڪو اسان ڪڏهن ڪڏهن ڪندا آهيون. حوالو CGM تصوير بغير گرم ڪرڻ جي حاصل ڪئي وئي (ليزر بند سان) ۽ بعد ۾ ليزر آن سان تصوير ۾ ساڳئي هنڌ تي قبضو ڪيو ويو.
خشڪ ماس جي ماپ ساڳئي CGM ڪئميرا استعمال ڪندي حاصل ڪئي وئي آهي درجه حرارت جي تصويرن لاءِ. CGM حوالن جون تصويرون حاصل ڪيون ويون آهن تيزيءَ سان ايڪس ۽ y ۾ نموني کي منتقل ڪرڻ دوران ايڪسپورٽ دوران بيڪٽيريا جي موجودگيءَ جي ڪري او ٽي ۾ ڪنهن به قسم جي بي رحميءَ جو اندازو لڳائڻ. بيڪٽيريا جي OT تصويرن مان، انهن جو بايوماس حاصل ڪيو ويو تصويرن جي هڪ مجموعو استعمال ڪندي منتخب ٿيل علائقن مٿان Matlab جي گھر جي ورهائڻ واري الگورتھم (ڏسو ذيلي سيڪشن "عددي ڪوڊ")، ريف ۾ بيان ڪيل طريقيڪار تي عمل ڪندي. 48. مختصر ۾، اسان تعلق استعمال ڪندا آهيون \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}y\)، جتي \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) آپٽيڪل ڊيپٿ تصوير آهي، \(m\) آهي خشڪ وزن ۽ \({{{{\rm{\alpha}}}}}\) هڪ مستقل آهي. اسان چونڊيو \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg، جيڪو جاندار سيلن لاءِ هڪ عام مستقل آهي.
25 ملي ميٽر قطر ۽ 150 µm ٿلهي هڪ ڍڪ پرچي سون جي نانو پارٽيڪلز سان گڏ هڪ AttofluorTM چيمبر (Thermofisher) ۾ رکيل هئي جنهن ۾ سون جي نانو ذرڙن کي منهن ڏيڻو پوندو. Geobacillus stearothermophilus هر ڏينهن تجربن کان اڳ LB وچولي (200 rpm، 60 ° C) ۾ رات جو اڳواٽ ڪيو ويو. 0.3 کان 0.5 جي نظرياتي کثافت (OD) سان G. اسٽريٿرموفيلس جي معطلي جي 5 µl جو هڪ قطرو سون جي نانو ذرات سان ڍڪيل سلپ تي رکيل هو. ان کان پوء، هڪ گول ڍڪ واري سلپ 18 ملي ميٽر قطر ۾ هڪ سوراخ 5 ملي ميٽر قطر جي وچ ۾ ڊراپ تي اڇلائي وئي، ۽ ساڳئي نظرياتي کثافت سان بيڪٽيريل معطلي جي 5 μl کي بار بار سوراخ جي مرڪز تي لاڳو ڪيو ويو. ڍڳن تي کوهه تيار ڪيا ويا ريف ۾ بيان ڪيل طريقيڪار جي مطابق. 45 (وڌيڪ معلومات لاءِ اضافي معلومات ڏسو). ان کان پوء 1 ml LB وچولي کي ڍڪڻ لاء شامل ڪريو ته جيئن مائع جي پرت کي سڪي وڃڻ کان روڪيو وڃي. انڪيوبيشن دوران وچولي جي بخار ٿيڻ کي روڪڻ لاءِ Attofluor™ چيمبر جي بند ٿيل لڪ مٿان آخري ڍڪيل ڍڪ رکيل آهي. جراثيم جي تجربن لاءِ، اسان spores استعمال ڪيا، جيڪي، روايتي تجربن کان پوءِ، ڪڏهن ڪڏهن مٿاهون ڍڪ ڍڪيندا هئا. سلفولوبس شيباٽي حاصل ڪرڻ لاء ساڳيو طريقو استعمال ڪيو ويو. ٽي ڏينهن (200 rpm، 75 ° C) Thiobacillus serrata جي شروعاتي پوکائي وچولي 182 (DSMZ) ۾ ڪئي وئي.
سون جي نانو ذرات جا نمونا ميڪلر بلاڪ ڪوپوليمر ليٿوگرافي ذريعي تيار ڪيا ويا. هن عمل کي باب ۾ تفصيل سان بيان ڪيو ويو آهي. 60. مختصر طور تي، گولڊ آئنز کي گڏيندڙ مائيڪلس ٽوليئن ۾ ڪوپوليمر کي HAuCl4 سان ملايو ويو. ان کان پوءِ صاف ٿيل ڍڪين کي محلول ۾ وجھي ڇڏيو ويو ۽ سون جي ٻج حاصل ڪرڻ لاءِ گھٽائڻ واري ايجنٽ جي موجودگي ۾ UV شعاع سان علاج ڪيو ويو. آخرڪار، سون جا ٻج پوکيا ويا KAuCl4 ۽ ايٿانولامين جي آبي محلول سان 16 منٽن لاءِ هڪ coverslip سان رابطو ڪري، جنهن جي نتيجي ۾ ويجھي انفراريڊ ۾ غير گوله واري سون جي نانو ذرات جي هڪ اڌ مدتي ۽ بلڪل يونيفارم ترتيب ڏني وئي.
انٽرفيروگرامس کي OT تصويرن ۾ تبديل ڪرڻ لاءِ، اسان استعمال ڪيو گھر جي ٺهيل الگورٿم، جيئن تفصيلي لنڪ ۾ ڏنل آھي. 33 ۽ هيٺ ڏنل عوامي مخزن ۾ Matlab پيڪيج جي طور تي دستياب آهي: https://github.com/baffou/CGMprocess. پئڪيج شدت ۽ OT تصويرن جي حساب سان رڪارڊ ٿيل انٽرفيروگرامس (بشمول حوالن جي تصويرن سميت) ۽ ڪئميرا جي صفن جي فاصلن جي بنياد تي ڪري سگھي ٿو.
ڏنل درجه حرارت جي پروفائيل کي حاصل ڪرڻ لاءِ SLM تي لاڳو ڪيل مرحلي جي نمونن کي ڳڻڻ لاءِ، اسان استعمال ڪيو اڳي ئي ترقي يافته گھر جو ٺهيل الگورٿم39,42 جيڪو هيٺ ڏنل عوامي مخزن ۾ موجود آهي: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. ان پٽ گهربل درجه حرارت جو ميدان آهي، جيڪو ڊجيٽل طور تي يا مونوڪروم بي ايم پي تصوير ذريعي سيٽ ڪري سگهجي ٿو.
سيلز کي ورهائڻ ۽ انهن جي خشڪ وزن کي ماپڻ لاءِ، اسان استعمال ڪيو اسان جو Matlab الگورٿم هيٺ ڏنل عوامي مخزن ۾ شايع ٿيل آهي: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. هر تصوير تي، صارف کي دلچسپي جي بيڪٽيريا يا mCFU تي ڪلڪ ڪرڻ گهرجي، وينڊ جي حساسيت کي ترتيب ڏيو، ۽ چونڊ جي تصديق ڪريو.
مطالعي جي ڊيزائن تي وڌيڪ معلومات لاء، ڏسو فطرت ريسرچ رپورٽ خلاصو هن مضمون سان ڳنڍيل آهي.
هن مطالعي جي نتيجن جي حمايت ڪندڙ ڊيٽا مناسب درخواست تي لاڳاپيل ليکڪن کان دستياب آهن.
ھن مطالعي ۾ استعمال ڪيل سورس ڪوڊ تفصيلي آھي طريقن جي سيڪشن ۾، ۽ ڊيبگ ورجن ڊائون لوڊ ڪري سگھجن ٿا https://github.com/baffou/ ھيٺين ذخيرن ۾: SLM_temperatureShaping، CGMprocess، ۽ CGM_magicWandSegmentation.
مهتا، آر.، سنگل، پي.، سنگهه، ايڇ، ڊملي، ڊي ۽ شرما، AK Insight into thermophiles and their wide-spectrum applications. مهتا، آر.، سنگل، پي.، سنگهه، ايڇ، ڊملي، ڊي ۽ شرما، AK Insight into thermophiles and their wide-spectrum applications.مهتا، آر، سنگل، پي، سنگهه، ايڇ، ڊملي، ڊي ۽ شرما، AK اوورويو آف تھرموفيلس ۽ انهن جي وسيع ايپليڪيشن. مهتا، آر.، سنگل، پي.، سنگھ، ايڇ، ڊملي، ڊي ۽ شرما، AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用. مهتا، آر، سنگل، پي، سنگهه، ايڇ، ڊملي، ڊي ۽ شرما، AK.مهتا آر.، سنگل پي.، سنگ ايڇ، ڊملي ڊي ۽ شرما AK، Thermophiles ۽ ايپليڪيشنن جو وسيع سلسلو.3 بايو ٽيڪنالاجي 6، 81 (2016).